RiboLace Mod. 1--核糖体提取试剂盒
核糖体是细胞内一种核糖核蛋白颗粒（ribonucleoprotein particle），主要由rna和蛋白质构成，其唯yi功能是按照mrna的指令将氨基酸合成蛋白质多肽链，所以核糖体是细胞内蛋白质合成的分子机器。核糖体无膜结构，主要由蛋白质（40%）和rna（60%）构成。核糖体按沉降系数分为两类，一类（70s）存在于细菌等原核生物中，另一类（80s）存在于真核细胞的细胞质中。
ribolace mod. 1核糖体提取试剂盒是一款由immaginabiotechnology公司基于嘌呤霉素（嘌呤霉素是一种蛋白质合成抑制剂,它具有与trna分子末端类似的结构,能够同氨基酸结合,代替氨酰化的trna同核糖体的a位点结合）通过无抗体、无融合标签蛋白的pull-down技术来分离活性核糖体的试剂盒。
操作使用
实验流程图
（1）实验前准备
另外需自备的材料
l10% 脱氧胆酸钠（dnase/rnase free water）
lcycloheximide
lribolock rnase抑制剂
lsuperase•in™ rna酶抑制剂
l无rna酶和depc水
l酸酚-氯仿混合液
lnanodrop nd-1000 uv-vis分光光度计
l糖原蓝色染料
l异丙醇
l微型离心机和无rna酶微量离心管（0.2 ml和1.5 ml）
l旋转器
l用于1.5ml试管的磁力支架
a.稀释ribolace smart probe：在ribolace smart probe中加入316.5 μl b-buffer，然后在冰上解冻。使用后，建议将混合物等分，并储存于-80℃，避免两次以上的反复冻融。
b.在裂解缓冲液lysis buffer使用前添加以下成分：脱氧胆酸钠（1%终浓度）、5u/ml dnase i和200u/ml ribolock rnase抑制剂。
（2）裂解
贴壁细胞裂解
a.裂解前，使用10 µg/ml的环己酰亚胺（chx）在37℃下处理细胞5 min。我们建议使用70-80 %汇合的细胞。chx处理可提高核糖体亲和纯化的效率，可选步骤。如果您使用的是人体或小鼠组织，请注意裂解缓冲液和w-缓冲液中都含有chx（10 ng/ml）。
b.孵育后，将细胞置于冰上，并用含有chx（20 µg/ml）的冷pbs快速洗涤。
c.用移液枪去除pbs
d.将加入了脱氧胆酸钠（1%终浓度）、5u/ml dnase i和200u/ml ribolock rnase抑制剂的裂解液加入细胞培养皿中进行裂解，并用力刮擦（适当的机械刮擦对有效裂解很重要）。
e.在1.5 ml离心管中收集细胞裂解物，并在20000 g离心5 min。
f.将上清液转移到新的试管中，冰浴20 min。
g.使用nanodrop分光光度计，取1 µl细胞裂解液，检测细胞裂解液在260 nm处的吸光度（设置nanoddrop的“核酸”功能）
悬浮细胞裂解
a.裂解前，使用10 µg/ml的环己酰亚胺（chx）在37℃下处理细胞5 min。我们建议使用70-80 %汇合的细胞。chx处理可提高核糖体亲和纯化的效率，可选步骤。如果您使用的是人体或小鼠组织，请注意裂解缓冲液和w-缓冲液中都含有chx（10 ng/ml）。
b.收集细胞，在4℃下以950 g离心5 min，弃培养基，用含有chx的冷pbs（20 µg/ml）快速洗涤细胞。
c.收集并在4℃下以950 g离心5 min。除去上清液，并用加入了脱氧胆酸钠（1%终浓度）、5u/ml dnase i和200u/ml ribolock rnase抑制剂的裂解液将细胞重悬。
d.通过g26针（约10次）使细胞裂解而不产生气泡。
e.20000 g离心5 min。
f.将上清液转移到新的试管中，冰浴20 min。
g.使用nanodrop分光光度计，取1 µl细胞裂解液，检测细胞裂解液在260 nm处的吸光度（设置nanoddrop的“核酸”功能）
组织裂解
a.用研钵和研杵在液氮下将纸巾碾碎。回收粉末于1.5 ml试管中
b.每10 mg组织加入800 µl 组织裂解液 (immagina cat. nr. #rl001-2)，请注意裂解缓冲液和w-缓冲液中都含有chx（10 ng/ml）。
c.20000g离心2min并收集上清液。
d.再次以20000g离心上清液5min，并收集上清液，冰浴20min。
e.使用nanodrop分光光度计，取1 µl细胞裂解液，检测细胞裂解液在260 nm处的吸光度（设置nanoddrop的“核酸”功能）
（3）磁珠处理
a.从4°c下取出ribolace磁珠，并将试管置于rt下至少30分钟。
b.将ribolace磁珠管涡旋30秒以上。
c.加入90µl ribolace磁珠至新的1.5 ml试管中。最终体积=90µl x n（n=样品数量），随后置于磁力架上，去除上清液。
d.取下试管，用等体积（90µl x n）的oh缓冲液洗涤ribolace磁珠5分钟，然后弃掉上清液。
e.向离心管中加入900µl不含核酸酶的水洗涤磁珠。
f.加入体积为（90µl x n）的b-缓冲液洗涤珠子，3分钟，共两次。将试管放于磁力架上至少1分钟，然后弃上清液。
g.加入（30µl x n）体积的稀释的ribolacesmart probe，1400 rpm室温孵育1 h，注意不要让磁珠沉淀，在孵育期间，可以进行核酸酶处理的步骤。
h.另取2 µl 已稀释的ribolace smart probe保存于冰上，作为后续验证。
i.孵育后，将试管放在磁力架上，留存3µl上清液作为验证。
j.向管中加入一定体积（3 µl x n）mpeg，在室温下在振荡器中混匀15min。注意不要让磁珠沉淀。
k.将试管置于磁力架上2-3min，弃上清液，加入500µl不含核酸酶的水洗涤。
l.加入500µl w缓冲液清洗磁珠，两次。
m.加入200µl的w缓冲液将ribolace磁珠重新悬浮，并根据样品的（n）个数将结合的磁珠等分。注意不要让磁珠变干。
n.结合效率的预估：将孵育后的上清液与未与磁珠孵育的ribolace smart probe在270 nm（nanodrop nd-1000）处的吸光度进行比较，可以估计磁珠结合效率（预计吸光度降低约10-50%）。
（4）核酸酶处理
a.将w缓冲液加入总体积为0.1-0.3 a. u（260nm）的裂解液，至最终体积为150µl。
b.加入0.3µlstabilizing nux solution (ss)，吸打混匀。
c.取2 ml管，加入1.5 µl核酸酶（nux），并加入98.5µl w缓冲液（wb）。用移液枪吸打5次，使稀释的nux溶液充分混匀。
d.加入稀释的核酸酶（nux）溶液于1.5 ml离心管中，25°c处理样品45min，核酸酶（nux）溶液使用体积（µl）为a.u x 5。
e.加入0.5µlsuperase•in™ rna酶抑制剂，冰浴10min。
（5）核糖体pull-down
仅在添加细胞裂解液之前，去除w缓冲液（步骤3.m中）
a.向步骤3.m中处理过的磁珠中加入处理过的细胞裂解液并充分混合。
b.4°c，慢速（3 rpm）孵育70分钟。
c.取出离心管，不要离心，置于冰浴的磁力架上，保持在冰上操作，分离磁珠。
注意不要将磁珠从磁力架上取下，也不要触摸磁珠。
d.500µl w缓冲液小心清洗磁珠两次。
e.从磁力架上取下，并用200µl w缓冲液将磁珠重悬。
f.将磁珠悬浮液转移至新的不含核酸酶的1.5ml离心管中。
（6）核糖体分离
a.向磁珠悬浮液中加入20µl 10%sds和5µl蛋白酶k，并在37°c水浴75min。
b.加入225µl酸性苯酚、氯仿、异戊醇混合物。
c.涡旋混匀，14000g离心5min。
d.如果离心后没有分离，可加入20µl2 mnacl（depc水），再次离心。
e.保留水相并将其转移至新的瓶中。
f.加入500µl异丙醇和2µl糖源蓝色染料。
g.混合并室温孵育3min，然后在-80°c下储存：
至少2小时或过夜。
h.4°c下离心（20000g）30min。
i.加入5µl无核酸酶水将rna沉淀重悬。
j.使用pagext试剂盒（cat. no##kge002_12）进行rpfs page纯化。
产品订购
品牌
产品名称
货号
反应次数
授权代理商
immaginabiotechnology
ribolace mod. 1
#rl001_mod. 1_12
12
上海起发实验试剂有限公司
常见问题
1.在进行ribolacepull-down之前，需要用环己酰亚胺处理细胞吗？
答：chx（环己酰胺）存在于试剂盒中包含的裂解液（lb）以及w缓冲液（wb）中。ribolace在使用或不使用环己酰亚胺的情况下都能很好地发挥作用。也就是说，细胞是否添加chx处理取决于实验设置。一些客户在起始密码子周围发现了由于chx引起的p位点周期性伪影。相反，chx可以使核糖体保护片段的长度在28个核苷酸处向更均匀的峰值移动。根据我们的经验，20 µg/ml的chx略微改善了p位点沿编码区的分辨率周期性。例如，从没有进行chx处理的快速冷冻脑组织中获得了良好的p位点周期性。如果您的样品易流失核糖体，我们建议增加w缓冲液中的chx浓度（目前为20 µg/ml，至40 µg/ml），并在每个w缓冲液中加入30 ml chx储备溶液（10 mg/ml）。
2.应该如何冷冻ribolace实验的样品？
答：对于使用chx裂解细胞，我们建议在进行ribolace之前进行细胞裂解，并将其保存在-80的温度下，保存时间最多1-2个月。
对于不使用chx裂解细胞，我们建议在进行ribolace之前，快速冷冻并储存在-80℃下，最多1-2个月。
对于组织样品，我们建议在进行ribolace之前，快速冷冻组织并将样品储存（-80℃）最多1-2个月。
3.不能在一天内完成所有的步骤。处理过的磁珠可以储存并第二天继续吗？
答：是的，可以停止。我们建议将磁珠保持在含有ribolace smart probe的溶液中，即在磁珠分离和加入mpeg之前。在室温1400 rpm孵育1 h后，可以将磁珠在4℃下储存过夜，不要冷冻。
4.ribolacemod. 1适用于哪些物种？
答：一般来说，ribolace在真核细胞和组织上效果良好，截至目前，已在哺乳动物细胞、小鼠和昆虫组织中得到验证。
5.试剂盒到货后有效期多久？
答：12个月
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品牌
产品
货号
规格
描述
immaginabiotechnology
riboseq all-in-one set (12rxn)
#rs-001s_12
12次-kit
set of ribolace module 1, laceseq, pageext and iudi laceseq plate
immaginabiotechnology
riboseq all-in-one set xl (12rxn)
#rs-012xls
12次-kit
set of ribolace module xl, laceseq, pageext and iudi laceseq plate
immaginabiotechnology
ribolace gelfree system
#gf001
12次-kit
set of ribolace gelfree module, laceseq and iudi laceseq plate
immaginabiotechnology
ribolace xl (12 rxn)
#rl001_xl
12次-kit
active ribosome profiling fragments extraction
immaginabiotechnology
laceseq (12rxn)
#ls001_12
12次-kit
laceseq for ribosomal profiling illumina sequencing
immaginabiotechnology
pagext: page extraction kit (24rxn)
#kge-002_12
24次-kit
rna (rpfs) and dnalibraries gel extraction
immaginabiotechnology iudi plate laceseq
#ls-udi-012a-12
12次-kit
iudi plate laceseq set 012a
immaginabiotechnology iudi plate laceseq
#ls-udi-012b-12
12次-kit
iudi plate laceseq set 012b
immaginabiotechnology iudi plate laceseq
#ls-udi-012c-12
12次-kit
iudi plate laceseq set 012c
immaginabiotechnology iudi plate laceseq
#ls-udi-012d-12
12次-kit
iudi plate laceseq set 012d
immaginabiotechnology aharibo translatome rnaseq
#tr001_12
12次-kit
set of aharibo core kit, rna module and rnaseq library prep for 12rxn
immaginabiotechnology aharibo core kit (12rxn)
#aha003_12
12次-kit
aharibo core kit (12rxn) for downstream rna and protein analysis
immaginabiotechnology aharibo module rna
#m-aha003-r
6次-kit
identification of the whole de novo synthesized translatome (rnas)
immaginabiotechnology aharibo module protein
#m-aha003-p
6次-kit
identification of the whole de novo synthesized proteome
immaginabiotechnology aharibo module western blotting
#m-aha003-w
6次-kit
identification of ribosomal and associated proteins (western blotting)
immaginabiotechnology circaid-p-seq
#ca001
6次-kit
library prep for oxford nanopore sequencing
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操作使用
实验流程图
（1）实验前准备
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l10% 脱氧胆酸钠（dnase/rnase free water）
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lribolock rnase抑制剂
lsuperase•in™ rna酶抑制剂
l无rna酶和depc水
l酸酚-氯仿混合液
lnanodrop nd-1000 uv-vis分光光度计
l糖原蓝色染料
l异丙醇
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l旋转器
l用于1.5ml试管的磁力支架
a.稀释ribolace smart probe：在ribolace smart probe中加入316.5 μl b-buffer，然后在冰上解冻。使用后，建议将混合物等分，并储存于-80℃，避免两次以上的反复冻融。
b.在裂解缓冲液lysis buffer使用前添加以下成分：脱氧胆酸钠（1%终浓度）、5u/ml dnase i和200u/ml ribolock rnase抑制剂。
（2）裂解
贴壁细胞裂解
a.裂解前，使用10 µg/ml的环己酰亚胺（chx）在37℃下处理细胞5 min。我们建议使用70-80 %汇合的细胞。chx处理可提高核糖体亲和纯化的效率，可选步骤。如果您使用的是人体或小鼠组织，请注意裂解缓冲液和w-缓冲液中都含有chx（10 ng/ml）。
b.孵育后，将细胞置于冰上，并用含有chx（20 µg/ml）的冷pbs快速洗涤。
c.用移液枪去除pbs
d.将加入了脱氧胆酸钠（1%终浓度）、5u/ml dnase i和200u/ml ribolock rnase抑制剂的裂解液加入细胞培养皿中进行裂解，并用力刮擦（适当的机械刮擦对有效裂解很重要）。
e.在1.5 ml离心管中收集细胞裂解物，并在20000 g离心5 min。
f.将上清液转移到新的试管中，冰浴20 min。
g.使用nanodrop分光光度计，取1 µl细胞裂解液，检测细胞裂解液在260 nm处的吸光度（设置nanoddrop的“核酸”功能）
悬浮细胞裂解
a.裂解前，使用10 µg/ml的环己酰亚胺（chx）在37℃下处理细胞5 min。我们建议使用70-80 %汇合的细胞。chx处理可提高核糖体亲和纯化的效率，可选步骤。如果您使用的是人体或小鼠组织，请注意裂解缓冲液和w-缓冲液中都含有chx（10 ng/ml）。
b.收集细胞，在4℃下以950 g离心5 min，弃培养基，用含有chx的冷pbs（20 µg/ml）快速洗涤细胞。
c.收集并在4℃下以950 g离心5 min。除去上清液，并用加入了脱氧胆酸钠（1%终浓度）、5u/ml dnase i和200u/ml ribolock rnase抑制剂的裂解液将细胞重悬。
d.通过g26针（约10次）使细胞裂解而不产生气泡。
e.20000 g离心5 min。
f.将上清液转移到新的试管中，冰浴20 min。
g.使用nanodrop分光光度计，取1 µl细胞裂解液，检测细胞裂解液在260 nm处的吸光度（设置nanoddrop的“核酸”功能）
组织裂解
a.用研钵和研杵在液氮下将纸巾碾碎。回收粉末于1.5 ml试管中
b.每10 mg组织加入800 µl 组织裂解液 (immagina cat. nr. #rl001-2)，请注意裂解缓冲液和w-缓冲液中都含有chx（10 ng/ml）。
c.20000g离心2min并收集上清液。
d.再次以20000g离心上清液5min，并收集上清液，冰浴20min。
e.使用nanodrop分光光度计，取1 µl细胞裂解液，检测细胞裂解液在260 nm处的吸光度（设置nanoddrop的“核酸”功能）
（3）磁珠处理
a.从4°c下取出ribolace磁珠，并将试管置于rt下至少30分钟。
b.将ribolace磁珠管涡旋30秒以上。
c.加入90µl ribolace磁珠至新的1.5 ml试管中。最终体积=90µl x n（n=样品数量），随后置于磁力架上，去除上清液。
d.取下试管，用等体积（90µl x n）的oh缓冲液洗涤ribolace磁珠5分钟，然后弃掉上清液。
e.向离心管中加入900µl不含核酸酶的水洗涤磁珠。
f.加入体积为（90µl x n）的b-缓冲液洗涤珠子，3分钟，共两次。将试管放于磁力架上至少1分钟，然后弃上清液。
g.加入（30µl x n）体积的稀释的ribolacesmart probe，1400 rpm室温孵育1 h，注意不要让磁珠沉淀，在孵育期间，可以进行核酸酶处理的步骤。
h.另取2 µl 已稀释的ribolace smart probe保存于冰上，作为后续验证。
i.孵育后，将试管放在磁力架上，留存3µl上清液作为验证。
j.向管中加入一定体积（3 µl x n）mpeg，在室温下在振荡器中混匀15min。注意不要让磁珠沉淀。
k.将试管置于磁力架上2-3min，弃上清液，加入500µl不含核酸酶的水洗涤。
l.加入500µl w缓冲液清洗磁珠，两次。
m.加入200µl的w缓冲液将ribolace磁珠重新悬浮，并根据样品的（n）个数将结合的磁珠等分。注意不要让磁珠变干。
n.结合效率的预估：将孵育后的上清液与未与磁珠孵育的ribolace smart probe在270 nm（nanodrop nd-1000）处的吸光度进行比较，可以估计磁珠结合效率（预计吸光度降低约10-50%）。
（4）核酸酶处理
a.将w缓冲液加入总体积为0.1-0.3 a. u（260nm）的裂解液，至最终体积为150µl。
b.加入0.3µlstabilizing nux solution (ss)，吸打混匀。
c.取2 ml管，加入1.5 µl核酸酶（nux），并加入98.5µl w缓冲液（wb）。用移液枪吸打5次，使稀释的nux溶液充分混匀。
d.加入稀释的核酸酶（nux）溶液于1.5 ml离心管中，25°c处理样品45min，核酸酶（nux）溶液使用体积（µl）为a.u x 5。
e.加入0.5µlsuperase•in™ rna酶抑制剂，冰浴10min。
（5）核糖体pull-down
仅在添加细胞裂解液之前，去除w缓冲液（步骤3.m中）
a.向步骤3.m中处理过的磁珠中加入处理过的细胞裂解液并充分混合。
b.4°c，慢速（3 rpm）孵育70分钟。
c.取出离心管，不要离心，置于冰浴的磁力架上，保持在冰上操作，分离磁珠。
注意不要将磁珠从磁力架上取下，也不要触摸磁珠。
d.500µl w缓冲液小心清洗磁珠两次。
e.从磁力架上取下，并用200µl w缓冲液将磁珠重悬。
f.将磁珠悬浮液转移至新的不含核酸酶的1.5ml离心管中。
（6）核糖体分离
a.向磁珠悬浮液中加入20µl 10%sds和5µl蛋白酶k，并在37°c水浴75min。
b.加入225µl酸性苯酚、氯仿、异戊醇混合物。
c.涡旋混匀，14000g离心5min。
d.如果离心后没有分离，可加入20µl2 mnacl（depc水），再次离心。
e.保留水相并将其转移至新的瓶中。
f.加入500µl异丙醇和2µl糖源蓝色染料。
g.混合并室温孵育3min，然后在-80°c下储存：
至少2小时或过夜。
h.4°c下离心（20000g）30min。
i.加入5µl无核酸酶水将rna沉淀重悬。
j.使用pagext试剂盒（cat. no##kge002_12）进行rpfs page纯化。
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immaginabiotechnology
ribolace mod. 1
#rl001_mod. 1_12
12
上海起发实验试剂有限公司
常见问题
1.在进行ribolacepull-down之前，需要用环己酰亚胺处理细胞吗？
答：chx（环己酰胺）存在于试剂盒中包含的裂解液（lb）以及w缓冲液（wb）中。ribolace在使用或不使用环己酰亚胺的情况下都能很好地发挥作用。也就是说，细胞是否添加chx处理取决于实验设置。一些客户在起始密码子周围发现了由于chx引起的p位点周期性伪影。相反，chx可以使核糖体保护片段的长度在28个核苷酸处向更均匀的峰值移动。根据我们的经验，20 µg/ml的chx略微改善了p位点沿编码区的分辨率周期性。例如，从没有进行chx处理的快速冷冻脑组织中获得了良好的p位点周期性。如果您的样品易流失核糖体，我们建议增加w缓冲液中的chx浓度（目前为20 µg/ml，至40 µg/ml），并在每个w缓冲液中加入30 ml chx储备溶液（10 mg/ml）。
2.应该如何冷冻ribolace实验的样品？
答：对于使用chx裂解细胞，我们建议在进行ribolace之前进行细胞裂解，并将其保存在-80的温度下，保存时间最多1-2个月。
对于不使用chx裂解细胞，我们建议在进行ribolace之前，快速冷冻并储存在-80℃下，最多1-2个月。
对于组织样品，我们建议在进行ribolace之前，快速冷冻组织并将样品储存（-80℃）最多1-2个月。
3.不能在一天内完成所有的步骤。处理过的磁珠可以储存并第二天继续吗？
答：是的，可以停止。我们建议将磁珠保持在含有ribolace smart probe的溶液中，即在磁珠分离和加入mpeg之前。在室温1400 rpm孵育1 h后，可以将磁珠在4℃下储存过夜，不要冷冻。
4.ribolacemod. 1适用于哪些物种？
答：一般来说，ribolace在真核细胞和组织上效果良好，截至目前，已在哺乳动物细胞、小鼠和昆虫组织中得到验证。
5.试剂盒到货后有效期多久？
答：12个月
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immaginabiotechnology
riboseq all-in-one set (12rxn)
#rs-001s_12
12次-kit
set of ribolace module 1, laceseq, pageext and iudi laceseq plate
immaginabiotechnology
riboseq all-in-one set xl (12rxn)
#rs-012xls
12次-kit
set of ribolace module xl, laceseq, pageext and iudi laceseq plate
immaginabiotechnology
ribolace gelfree system
#gf001
12次-kit
set of ribolace gelfree module, laceseq and iudi laceseq plate
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ribolace xl (12 rxn)
#rl001_xl
12次-kit
active ribosome profiling fragments extraction
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laceseq (12rxn)
#ls001_12
12次-kit
laceseq for ribosomal profiling illumina sequencing
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pagext: page extraction kit (24rxn)
#kge-002_12
24次-kit
rna (rpfs) and dnalibraries gel extraction
immaginabiotechnology iudi plate laceseq
#ls-udi-012a-12
12次-kit
iudi plate laceseq set 012a
immaginabiotechnology iudi plate laceseq
#ls-udi-012b-12
12次-kit
iudi plate laceseq set 012b
immaginabiotechnology iudi plate laceseq
#ls-udi-012c-12
12次-kit
iudi plate laceseq set 012c
immaginabiotechnology iudi plate laceseq
#ls-udi-012d-12
12次-kit
iudi plate laceseq set 012d
immaginabiotechnology aharibo translatome rnaseq
#tr001_12
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immaginabiotechnology aharibo core kit (12rxn)
#aha003_12
12次-kit
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#m-aha003-p
6次-kit
identification of the whole de novo synthesized proteome
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#m-aha003-w
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#ca001
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