高通量筛选案例：基于突变体文库的无细胞表达筛选——phi29 DNA聚合酶
摘要
酶是自然界重要的功能蛋白分子，其催化活性在基因编辑及干细胞技术、靶向药物的生产、食品工业、纺织工业、医学诊断、药物制备等领域都有着重要的作用。本文中，我们以phi29 dna聚合酶为代表，利用无细胞蛋白表达技术，搭建了高通量酶筛选平台。结果显示，在三天内，我们就完成了96个phi29 dna聚合酶突变体的表达，并对其活性进行了检测，找到了较为高效的phi29 dna聚合酶突变体。
近几年，随着ai技术的进步，ai辅助蛋白设计正在逐渐成为现实。在ai的设计-构建-测试-学习周期中，构建和测试对ai的成长有着极大的作用。
一般传统的蛋白表达流程为：
利用半理性的方式完成突变体基因的构建后，将构建的基因搭载至质粒上，再将质粒转化进载体细胞内。然后从涂布的平板上挑取单克隆进行扩大培养，随后可以得到表达突变体蛋白的细胞株。通过细胞株的扩大培养，之后裂解相应细胞，即可得到含有目的突变蛋白的混合液。在此之后就可以进行突变蛋白的纯化和测试操作。该方法操作复杂且流程较长，如果目的突变蛋白对宿主细胞有毒害作用的话，可能会导致表达失败。
对于这种高通量筛选来说，无细胞蛋白表达显然是一种更有效的选择。无细胞蛋白表达技术，利用裂解的生物体的生物质，如核糖体、转录翻译酶等成分，再加入合适的能量氨基酸等支持体系，即可在体外借助加入的模板dna，实现快速高效的蛋白表达。无细胞蛋白表达技术可以有效地简化蛋白表达的操作，使其更易于匹配高通量的应用场景。同时其快速表达的特点，可以缩短蛋白表达的时间，有效缩短项目周期。
本文我们以phi29 dna聚合酶为例子，利用无细胞蛋白表达技术，在三天内高效表达出了96个蛋白酶突变体，并检测其活性。揭示了无细胞技术在蛋白酶及药物高通量筛选中的潜在应用。
方法
突变引入及环化
我们选取了phi29dna聚合酶的第221位和第350位氨基酸作为突变位点。先利用pcr的方式，将突变通过引物引入片段；再通过重叠pcr的方式整合突变片段。将整合好的目的基因片段和线性化的环状片段通过seamless酶进行连接，形成环化质粒。
在此过程中，每次以质粒为模板进行pcr之后，使用dpn i 酶37℃消化1h以去除原始模板。
质粒转化并涂板
取5μl引入突变的质粒，加入到100μl dh5α感受态细胞中，轻轻混匀，置于冰上30min。接着，将上述感受态细胞置于42°c水浴中，热激90秒后迅速放回冰浴中，静置3~5min；再将其加入到500 ul不含抗生素的soc或lb培养液中，轻轻混匀，37°c震荡培养1h。随后，通过离心菌液（5000 rpm ，1min）沉淀菌体，再将大部分培养液移除，剩余约50-100μl的培养液后重悬菌体，最后，全部均匀涂布到含卡那霉素的lb平板上，在37°c培养箱中培养过夜。
挑取单克隆并保菌
向96孔板中加入100μl含有卡那霉素的lb培养基，然后从lb培养板上挑取单克隆菌落加入96孔板中。再置于37℃的摇床中180rpm震荡培养1h。
菌体pcr及高通量蛋白表达
从震荡培养1h的96孔板的每个孔中取出1μl培养基，作为模板加入pcr体系。在经过适当的pcr程序后，取5μlpcr反应体系，作为模板加入无细胞表达体系中。表达4个小时后，即可在体系中产生目的蛋白酶——phi29 dna 聚合酶。
活性测定
phi29 dna聚合酶的活性测定是利用聚合酶活性来扩增绿色荧光蛋白基因的线性模板，通过最终产物绿色荧光的强度对phi29 dna聚合酶的活性做出判断。首先从最终的无细胞反应体系中直接取出1μl的反应上清液作为酶溶液加入到扩增体系，该体系含有使phi29起效的缓冲液、绿色荧光蛋白基因的质粒模板以及扩增所需的引物。然后在42℃的条件下扩增2h生成线性模板。最后取5μl的线性模板加入到终体积为50μl的无细胞反应体系中，6小时后测定其荧光值，找出活性较强的phi29 dna聚合酶突变体。
结果
活性结果
在激发波长485nm发射波长535nm的条件下，测定绿色荧光蛋白的荧光值。不同孔中的荧光值有明显的不同，表明不同phi29 dna聚合酶的突变体有不同的活性强度。
突变测序
测定活性之后，从之前保存的96孔培养板上取活性强度较高的几个孔位所对应的菌体，扩大培养后进行测序操作。我们成功找到了在此板上活性强度的phi29 dna聚合酶突变体。其在221位和350位的氨基酸组合如下所示。
活性排名 221 350
1 苯丙氨酸 苯丙氨酸
2 苯丙氨酸 酪氨酸
3 异亮氨酸 苏氨酸
结论
通过上述实验，珀罗汀生物展示了一种运用无细胞蛋白表达技术，高通量筛选并验证突变蛋白的方法。该方法在3天内完成了近百种突变蛋白的构建表达及活性验证，显著缩短了蛋白筛选的时间，减少了人工操作成本，提高了研发效率。
蛋白质生物活性和稳定性的不断提升，对于蛋白类产品在医疗、农业、造纸、纺织、生物能源、家庭护理等方面推广应用，有着举足轻重的作用。运用无细胞蛋白表达技术，能够更高效快速地完成蛋白质改造与筛选，缩短酶制剂、蛋白药物等各类蛋白产品的研发周期，降低研发成本，从而促进新型重组蛋白、酶、抗体等蛋白产品的快速发展。
珀罗汀生物作为一家专业的无细胞蛋白表达生物技术公司，将继续利用无细胞蛋白表达技术优势，开发更为广泛的应用场景。
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近几年，随着ai技术的进步，ai辅助蛋白设计正在逐渐成为现实。在ai的设计-构建-测试-学习周期中，构建和测试对ai的成长有着极大的作用。
一般传统的蛋白表达流程为：
利用半理性的方式完成突变体基因的构建后，将构建的基因搭载至质粒上，再将质粒转化进载体细胞内。然后从涂布的平板上挑取单克隆进行扩大培养，随后可以得到表达突变体蛋白的细胞株。通过细胞株的扩大培养，之后裂解相应细胞，即可得到含有目的突变蛋白的混合液。在此之后就可以进行突变蛋白的纯化和测试操作。该方法操作复杂且流程较长，如果目的突变蛋白对宿主细胞有毒害作用的话，可能会导致表达失败。
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本文我们以phi29 dna聚合酶为例子，利用无细胞蛋白表达技术，在三天内高效表达出了96个蛋白酶突变体，并检测其活性。揭示了无细胞技术在蛋白酶及药物高通量筛选中的潜在应用。
方法
突变引入及环化
我们选取了phi29dna聚合酶的第221位和第350位氨基酸作为突变位点。先利用pcr的方式，将突变通过引物引入片段；再通过重叠pcr的方式整合突变片段。将整合好的目的基因片段和线性化的环状片段通过seamless酶进行连接，形成环化质粒。
在此过程中，每次以质粒为模板进行pcr之后，使用dpn i 酶37℃消化1h以去除原始模板。
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挑取单克隆并保菌
向96孔板中加入100μl含有卡那霉素的lb培养基，然后从lb培养板上挑取单克隆菌落加入96孔板中。再置于37℃的摇床中180rpm震荡培养1h。
菌体pcr及高通量蛋白表达
从震荡培养1h的96孔板的每个孔中取出1μl培养基，作为模板加入pcr体系。在经过适当的pcr程序后，取5μlpcr反应体系，作为模板加入无细胞表达体系中。表达4个小时后，即可在体系中产生目的蛋白酶——phi29 dna 聚合酶。
活性测定
phi29 dna聚合酶的活性测定是利用聚合酶活性来扩增绿色荧光蛋白基因的线性模板，通过最终产物绿色荧光的强度对phi29 dna聚合酶的活性做出判断。首先从最终的无细胞反应体系中直接取出1μl的反应上清液作为酶溶液加入到扩增体系，该体系含有使phi29起效的缓冲液、绿色荧光蛋白基因的质粒模板以及扩增所需的引物。然后在42℃的条件下扩增2h生成线性模板。最后取5μl的线性模板加入到终体积为50μl的无细胞反应体系中，6小时后测定其荧光值，找出活性较强的phi29 dna聚合酶突变体。
结果
活性结果
在激发波长485nm发射波长535nm的条件下，测定绿色荧光蛋白的荧光值。不同孔中的荧光值有明显的不同，表明不同phi29 dna聚合酶的突变体有不同的活性强度。
突变测序
测定活性之后，从之前保存的96孔培养板上取活性强度较高的几个孔位所对应的菌体，扩大培养后进行测序操作。我们成功找到了在此板上活性强度的phi29 dna聚合酶突变体。其在221位和350位的氨基酸组合如下所示。
活性排名 221 350
1 苯丙氨酸 苯丙氨酸
2 苯丙氨酸 酪氨酸
3 异亮氨酸 苏氨酸
结论
通过上述实验，珀罗汀生物展示了一种运用无细胞蛋白表达技术，高通量筛选并验证突变蛋白的方法。该方法在3天内完成了近百种突变蛋白的构建表达及活性验证，显著缩短了蛋白筛选的时间，减少了人工操作成本，提高了研发效率。
蛋白质生物活性和稳定性的不断提升，对于蛋白类产品在医疗、农业、造纸、纺织、生物能源、家庭护理等方面推广应用，有着举足轻重的作用。运用无细胞蛋白表达技术，能够更高效快速地完成蛋白质改造与筛选，缩短酶制剂、蛋白药物等各类蛋白产品的研发周期，降低研发成本，从而促进新型重组蛋白、酶、抗体等蛋白产品的快速发展。
珀罗汀生物作为一家专业的无细胞蛋白表达生物技术公司，将继续利用无细胞蛋白表达技术优势，开发更为广泛的应用场景。
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